去内毒素试剂盒
使用说明书
仅供体外研究使用,不用于临床诊断!
第1版(2016年04月修订)
关联信息
细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有成份,它是一种外源性致热原,可通过激活巨噬细胞、中性粒细胞等引起炎性介质的释放,导致机体的损伤,严重者可引发脓毒性休克甚至死亡。而内毒素又是生物制品的重要污染物,所以,对于直接进入人体或者动物体内的生物制品、药品都必须严格控制其内毒素含量。因此,内毒素的去除对于一些生物制品的下游纯化处理来说就显得非常重要。
原理
多粘菌素(Polymyxin)是由多粘芽胞杆菌(Bacilluspolymyxa)产生的一组多肽类抗生素。其中,多粘菌素B(PMB)能拮抗细菌内毒素,虽然他们的结合机理还存在很多争议,但是它们之间是通过静电作用,离子作用和亲水作用等多种因素共同作用的结果是大家普遍接受的事实。本试剂盒基于这一原理利用亲和树脂中的多粘菌素B与内毒素特异性的结合去除样品中的内毒素。亲和树脂的主要特性如下表:
规格 | 1.5 ml 预装柱 |
结合能力 | ≥2,000,000 EU/ml 树脂 |
配基 | 修饰的多粘菌素 B (PMB) |
pH范围 | pH 5-10 |
基质 | 4% 交联的琼脂糖凝胶 |
颗粒大小 | 90 µm |
保存温度 | 2°C-8°C |
使用寿命 | 18 个月 |
平衡缓冲液 | 磷酸盐缓冲液,pH 8.0 |
离子条件 | 0.1-0.5 M NaCl |
可耐受试剂 | 20% DMSO,,20% 乙醇,20% 甘油,1 M 尿素,300 mM 咪唑, 0.05% 吐温-20, 10 mM DTT 等 |
产品组分
名称 | 规格 |
亲和树脂 | 1.5 ml 预装柱 |
再生缓冲液 | 250 ml |
平衡缓冲液 | 250 ml |
流速控制器 | 1 个 |
无热原接收管 | 1 包 (3 支/包) |
无热原枪头(1 ml) | 2 包(6 支/包) |
说明书 | 1 份 |
*亲和树脂重复使用5次不改变结合效率
还需准备的设备和试剂
1. 纯化柱支架
2. 0.1M NaOH和0.1M HCl,用于调节样品PH值
3. 氯化钠和乙醇
储存及有效期
4℃保存,有效期一年。
适用范围
蛋白,多肽,抗体,多糖等溶液中内毒素的去除,样品最终的内毒素水平可低于0.1 EU/ml。
操作步骤
1. 样品处理:结合内毒素的pH范围为5-10,pH范围7-8进行纯化最佳。样品在0.15-0.5M NaCl的条件可以明显增强特异性吸附并降低非特异性吸附。纯化之前可以使用无内毒素的5M氯化钠、0.1 M NaOH或0.1M HCl来调节离子强度或PH值。
2. 活化树脂:垂直装配好预装柱,去除顶部盖子,打开流速控制器,使保护液流干。加入5ml再生缓冲液,调节流速控制器,保持流速在0.25ml/min(或10滴/min),待再生缓冲液流干后再加入5ml再生缓冲液,重复操作2次,以确保体系中无热源(即内毒素)存在。(注意:第一次使用也必须进行本步骤。)
3. 平衡树脂:加入6ml的平衡缓冲液,调节流速控制器,保持流速在0.5ml/min,流干平衡缓冲液,再按此操作重复2次。
4. 内毒素去除:将流速控制器关闭,使用无热源枪头加入样品,打开控制器,控制流速不高于0.25ml/min,流出液体积达到1.5ml后,使用无热源接收管收集样品。待样品流干后,再加入1.5ml-3.0ml的平衡缓冲液淋洗,收集淋洗液。检测样品浓度及所含内毒素水平。(如果流出样品内毒素水平未能达到预期值,需要将预装柱按照步骤2重新再生,然后上样纯化。)
5. 柱保存:预装柱用完后,先用10ml平衡缓冲液平衡柱,待平衡液流干,加入1.5ml的再生缓冲液(含0.02%的叠氮化钠),2℃‐8℃保存。
注意事项
1. 在使用本产品过程,请严格控制操作环境,防止外来内毒素污染纯化过的样品。
2. 试剂盒内物内毒素枪头盒收集管开封后,一次性用完。
3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
问题及解决方法
问题 | 问题原因 | 解决方法 |
去除效率低 | 样品的pH值过高或者过低,不在最适范围 | 调节pH至7-8 |
样品和亲和树脂孵育时间太短 | 降低样品的流速,或者通过低温孵育来解决 | |
去除或检测系统受到外来因素污染 | 使用无热源的实验仪器,保证体系不受污染 | |
内毒素与目的蛋白结合太牢固 | 1. 优化样品的pH,使它们解离 2. 增加接触样品与亲和树脂的时间 | |
样品损失高 | 样品通过非特异性作用结合在亲和树脂上 | 增加样品和平衡缓冲液中NaCl的含量 |
目的蛋白与内毒素结合牢固 | 1. 优化样品的pH,使内毒素解离出来 2. 增加接触样品与亲和树脂的时间 | |
样品被污染 | 同一根柱子处理不同的样品 | 尽量避免使用同一个预装柱处理不同样品。 如果无法避免,可以在处理一个样品之后,用10-20 ml 2M NaCl淋洗树脂,然后再处理另外一 种样品 |
再生缓冲液出现浑浊 | 当再生缓冲液达到室温时将会出现浑浊 | 使用之前在冰上冷却再生缓冲液或者在4℃条件下进行再生 |